東北大学とプロトセラ、パーキンソン病進行抑制療法の候補分子絞り込みに成功

東北大学大学院医学系研究科 神経内科学分野の長谷川 隆文（はせがわ たかふみ）准教授とウシオ電機株式会社（本社：東京都、執行役員社長　内藤 宏治）の連結子会社である株式会社プロトセラ （本社：大阪府、代表取締役社長 田中 憲次、以下プロトセラ）は、共同でパーキンソン病進行抑制療法の候補分子探索を実施し、その成果を2019年4月9日付で特許出願しました。

哺乳動物の脳組織に存在する新規の線維化α-Syn^※1受容体候補タンパク質が同定されたことにより、線維化α-Syn細胞間伝播メカニズムの一端が明らかにされるとともに、線維化α-Syn取り込みをターゲットとした伝播阻害薬の開発が期待されます。


【発明の名称】
パーキンソン病をはじめとするレビー小体病を対象とした進行抑制療法の候補分子スクリーニング

【ポイント】
・プロトセラの特許技術を用いて、マウス全脳に由来するパーキンソン病の病態分子（線維化α-Syn）と結合する膜タンパク質（線維化α-Syn受容体候補分子）の網羅的探索を行った。
・線維化α-Syn受容体として複数の候補分子を同定することに成功した。
・線維化α-Syn受容体候補となる膜タンパク質情報を基に、新たな医薬品開発を目指す。

 

なお、本研究成果は2019年5月25日に第60回日本神経学会学術大会（会場：大阪府立国際会議場[グランキューブ大阪]・リーガロイヤルホテル大阪）で発表予定です。

■発表演題 Pe-068-2
Comprehensive screening of the cell surface receptor for alpha-synuclein fibrils


【研究内容】
パーキンソン病（Parkinson’s disease: PD）をはじめとするレビー小体病（Lewy body disease: LBD）は、アルツハイマー病に次いで頻度の高い神経変性疾患（PD/LBD）です。体の動きに障害が現れる疾患で、①動作が遅くなる、②手足が震える、③筋肉が固くなる、④バランスが取れなくなる、といった病態を示します。病理学的には、構造変化により病的な線維化を生じたα-シヌクレイン（α-Synuclein: α-Syn）というタンパク質を主成分とするレビー小体（Lewy body: LB）の出現と、運動を調節する神経細胞（中脳黒質・青斑核のカテコラミン産生神経細胞）の減少を特徴とします。PD/LBD患者の脳では、線維化α-Synが神経細胞間を伝播することで病変が拡大する可能性が指摘されています。さらに、神経細胞への線維化α-Syn取り込みには、細胞表面にある膜タンパク質（α-Syn受容体）が関与する事が示唆されています。

今回、プロトセラの特許技術であるMembrane Protein Library®（MPL）法^※2とBLOTCHIP®-MS法^※3の組み合わせ技術によって、世界に先駆けて脳組織からの線維化α-Syn受容体の網羅的探索を実施し、複数の候補分子を同定することに成功しました。今後は、線維化α-Syn受容体候補となる膜タンパク質情報を基に、新たな医薬品開発を目指します。
 
【発表者コメント】

「神経・グリア細胞表面に発現し線維化α-Syn受容体として機能する分子が近年複数報告されています。一方、線維化α-Synは生体膜そのものと非特異的に結合しやすく、全脳を対象とした線維化α-Syn受容体の網羅的探索は未だ実現出来ていませんでした。この問題を克服するためには既存の方法には限界があり、視点を変えたアプローチが必要となります。
我々は、マウス全脳由来の膜タンパク質を人工脂質二重膜へ再配置することでライブラリ化した後、線維化α-Synをリガンドとして結合分子をスクリーニングし、LC-MS/MS法による構造解析により受容体候補タンパク質を網羅的に探索するという研究手法を用い、新規の線維化α-Syn受容体候補タンパク質を複数同定することに成功しました。
今後、線維化α-Syn受容体候補分子に対する特異抗体や結合阻害分子を用いることで、選択的かつ効率的に線維化α-Syn取込み・伝播を抑制するPD/LBD進行抑制療法の開発を目指したいと考えています。」

「神経変性疾患（neurodegenerative disease）は、それぞれ特有の領域の神経系統が侵され、神経細胞を中心とする様々な退行性変化を呈する疾患群です。アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症などがこの疾患群に属します。
今回確立された技術によってパーキンソン病治療薬の標的候補の発見に至りましたが、この技術が他の神経変性疾患の治療標的の探索にも有用であることは明らかです。認知症は2050年には世界で1億3000万人を上回ると予測され、世界の製薬大手企業が競って治療薬の開発を進めましたが、相次いで失敗しています。当社としてもこの薬の開発を非常に重視しており、今後最善のパートナーを募って開発を目指します。」　　　　　　　　

【研究の方法】
マウス脳組織を破砕後、遠心分離で膜タンパク質を回収し、卵黄レシチンからなるリポソームと融合させて膜タンパク質ライブラリ（Membrane Protein Library®：MPL）を調製しました。リガンドとなる単量体および線維化α-Synを別々のセファロースに固定し、マウス脳組織由来MPLの中から各α-Synに結合する膜タンパク質を精製しました。精製物をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、標的バンドを切り出し、トリプシン消化に続いてLC-MS/MS法による構造解析の結果、単量体α-Synに比較して線維化α-Synにより強く特異吸着する複数の膜タンパク質が同定されました。

 

※1 線維化α-Syn

神経細胞に豊富に存在する140アミノ酸からなる機能不明のタンパク質です。天然状態のαシヌクレインは特定の構造をもたない可溶性タンパク質ですが、種々のストレスや遺伝子変異により構造変化を来たし、凝集し不溶性のタンパク質（線維化αシヌクレイン）となります。パーキンソン病患者の脳神経・末梢神経細胞内には、線維化αシヌクレインが多量に蓄積しており、発見者の名にちなんでレビー小体とよばれます。線維化αシヌクレインには細胞毒性があり、パーキンソン病の発症・病態進行において主要な役割を演じていることが判っています。


※2 Membrane Protein Library®（MPL）法

細胞膜に存在する受容体は水に溶けないため、従来のタンパク質の精製、同定、性状分析といった解析技術が有効に働きませんでした。
プロトセラは受容体をその構造特性に関わらず人工リポソームのリン脂質二重層に再構成し、リガンド結合能を保持したままで膜タンパク質ライブラリ（Membrane Protein Library®; MPL）と呼ばれるエマルジョン溶液に転換する技術を確立し、培養細胞から組織や臓器に存在するあらゆる受容体を大量かつ安定的に供給できるようになりました（図1）。このMPL法にBLOTCHIP®-MS法を組み合わせた複合技術により、未知のリガンドと未知の受容体を包括的に探索・同定、さらに両者間の相互作用を解析することが可能になりました。
 


※3 BLOTCHIP®-MS法

従来の血液からあらかじめタンパク質を除去する解析方法では、タンパク質に結合したペプチドも除去されるため、ペプチドの全量を正確に測定することができませんでした。一切の前処理を必要としないBLOTCHIP®-MS法によって初めて生体試料中のペプチドの全量を定量できるようになりました。また、BLOTCHIP®-MS法は解析中の煩雑で長時間かかる操作を不要にした結果、多量の試料を短時間で測定できるようになり、従来のペプチドーム解析技術のボトルネックが解消されました（図2）。